La diagnostica sierologica delle malattie bollose autoimmuni viene eseguita routinariamente mediante l’immunofluorescenza indiretta. Questa metodica spesso non riesce a discriminare tra le diverse patologie che pur presentando lo stesso pattern hanno un diverso target antigenico. Così di fronte ad un marcaggio intercellulare o della membrana basale non sappiamo verso quale/i antigene/i desmosomiale/i o della giunzione dermo-epidermica sono diretti gli autoanticorpi circolanti, non riuscendo a fare diagnosi di precisione tra i diversi sottotipi di patologie.

L’Immunoblotting (IB) è una delle metodiche sierologiche capace di individuare la specificità antigenica nelle diverse malattia bollose autoimmuni. E’ una metodica relativamente semplice che utilizza estratti proteici che contengono gli antigeni target che vengono estratti da tessuti umani, epidermide e derma, da tessuti animali quali la mucosa bovina, e da culture cellulari cheratinocitarie e amniotiche. Queste proteine vengono denaturate, caricate su un gel di poliacrilamide e separate per elettroforesi in base al loro peso molecolare. Le proteine così separate vengono poi transferite elettroforeticamente su una membrana inerte di nitrocellulosa per facilitarne i successivi passaggi: incubazione con il siero del paziente, utilizzo di antisieri coniugati e rivelazione.

E’ una metodica che oltre a presentare un’ottima specificità presenta una buona sensibilità diagnostica. Nel pemfigo l’IB ha in media una buona sensibilità per l’antigene del pemfigo volgare la desmogleina 3 (80%), mentre la sua sensibilità diagnostica per l’antigene del pemfigo superficiale, la desmogleina 1, è nettamente inferiore (53%). Nel pemfigo paraneoplastico molti sono gli antigeni target che caratterizzano immunologicamente la patologia, ma quelli che maggiormente sono evidenziati in IB e quindi diagnostici di malattia sono la periplachina (94%) e l’envoplachina (91%). La sensibilità diagnostica dell’IB nelle malattie bollose autoimmuni intraepidermiche, è comunque strettamente correlata alla scelta del tipo di lisato proteico utilizzato.

Sensibilità diagnostica dell’immunoblotting per i principali antigeni target delle malattie bollose autoimmuni intraepidermiche.

Dsg3: desmogleina 3

Dsg1: desmogleina 1

Per: periplachina

Env: envoplachina

Al contrario la diagnostica sierologica delle malattie bollose della giunzione dermo- epidermica, non sembra dipendere dal lisato proteico scelto. Su 794 casi di pemfigoide bolloso (PB) studiati l’IB ha permesso la diagnosi nel 79% dei casi, individuando l’antigene maggiore di 230 kDa nella metà dei casi circa, mentre l’antigene minore di 180 kDa è stato evidenziato nel 24% dei casi e l’associazione 230-180 kDa nel 25% dei casi. Al contrario nell’Herpes gestationis l’antigene maggiormente rappresentato è l’antigene di 180 kDa che si è evidenziato nel 67% dei casi studiati. Il pemfigoide delle mucose (PM) presenta invece nell’84% dei casi studiati, una reattività diretta verso l’antigene minore del pemfigoide bolloso di 180 kDa o verso l’antigene di 97kDa. Infine nell’epidermolisi bollosa acquisita, l’utilizzo del lisato proteico appropriato risulta fondamentale, proprio per la difficoltà di diagnosi sierologica in questa patologia. L’estratto dermico apparentemente non è appropriato in quanto presenta una sensibilità diagnostica insufficiente (33%), mentre il lisato di cellule amniotiche (cellule WISH) permette di fare diagnosi nel 62%.

Immunoblotting su estratto di cheratinociti: reattività dirette verso i diversi antigeni target

230 kDa : antigene maggiore del pemfigoide bolloso

180 kDa : antigene minore del pemfigoide bolloso

160 kDa: desmogleina 1 antigene del pemfigo superficiale

130 kDa: desmogleina 3 antigene del pemfigo volgare

Sensibilità diagnostica dell’immunoblotting nelle principali malattie bollose autoimmuni della giunzione dermo-epidermica utilizzando differenti lisati

PB: pemfigoide bolloso

HG: herpes gestationis

PM: pemfigoide delle mucose

EBA: epidermolisi bollosa acquisita

L’IB è quindi una metodica che presenta un elevata specificità e una grande sensibilità a condizione di utilizzare il lisato appropiato: i lisati cheratinocitari e quelli animali di origine bovina per la diagnosi del pemfigo volgare e superficiale, l’epidermide umana per la diagnosi del pemfigoide bolloso e delle sue varianti, e le colture di cellule WISH per la diagnosi dell’epidermolisi bollosa acquisita. Inoltre recentememte l’utilizzo di proteine ricombinanti ha ulteriormente aumentato la sensibilità diagnostica di questa metodica.

Infine oltre al potere diagnostico l’IB, proprio per la sua capacità ad individuare gli antigeni specifici di malattia, risulta una metodica fondamentale e insostituibile per la ricerca clinica.

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