Università degli Studi di Napoli Federico II

Facoltà di Medicina e Chirurgia

Dipartimento di Patologia Sistematica

Sezione di Dermatologia

Facoltà di Medicina Veterinaria

Dipartimento di Scienze Cliniche Veterinarie

Sezione di Clinica Medica

AMBIENTE  ANIMALI  E  CUTE

CORSO  TEORICO  PRATICO

6-7 dicembre 2002

 

 
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IL LABORATORIO E LA RICERCA DEI MICETI*

E.M. Difonzo

Dipartimento di Scienze Dermatologiche

Università di Firenze

La natura micetica di una affezione cutanea e/o mucosa, già sospettata in base ad elementi clinici, va sempre documentata attraverso la dimostrazione del micete.

Gli esami di cui si avvale il Laboratorio Micologico rendono quasi sempre possibile questa dimostrazione. In caso di negatività e in presenza di lesioni fortemente sospette questi esami vanno ripetuti in tempi diversi e in punti diversi della lesione.

Le indagini di laboratorio permettono:

  • la dimostrazione del micete nelle lesioni;

  • l'isolamento del micete sui terreni di coltura;

  • l'identificazione di genere e di specie sulla base dei caratteri macroscopici, microscopici e fisiologici del micete isolato.

  • Per brevità di tempo limiteremo l’esposizione alla diagnosi delle dermatofitosi.

Dimostrazione del micete

La dimostrazione del micete nelle lesioni cutanee è possibile con l'esame microscopico diretto. Più raramente possono essere d'aiuto l'esame istologico e altre tecniche particolari.

1) Esame microscopico diretto

L'esame microscopico diretto è un evento di grande importanza nella diagnostica delle micosi perchè permette la visualizzazione del micete nelle lesioni senza modificare la morfologia degli elementi fungini. Questa indagine è il metodo di diagnosi più rapido e sicuro e permette di svelare anche ife poco vitali che non sarebbero in grado di dare origine a colonie sui terreni artificiali di coltura. Per la tinea pedis interdigitale, ad esempio, la percentuale di sicurezza dell'esame microscopico diretto è calcolata essere del 90-100%. Il suo allestimento è molto semplice: il principio è quello di sottoporre il materiale da esaminare ad un processo di macerazione e/o chiarificazione ottenendo un monostrato di cellule epiteliali rammollite e rigonfie senza alterare le strutture fungine.

L’attendibilità dei reperti è in gran parte legata alle modalità del prelievo. La mancata dimostrazione di elementi miceliali in una lesione sospetta può essere legata a banali errori tecnici nel prelievo del materiale, quali ad esempio squame troppo grosse, materiale insufficiente, prelievo eseguito su lesioni già trattate o in zone meno attive dell’infezione.

Per dare degli esempi: in presenza di lesioni eritemato-squamose (come tinea corporis e tinea cruris) il prelievo va eseguito raschiando la parte più periferica delle lesioni con un bisturi e/o con un cucchiaio tagliente (sterili!) e raccogliendo numerose squame (almeno 30- 50); in caso di lesioni vescicolose (ad esempio tinea pedis plantare) va prelevato il tetto delle vescicole e/o i lembetti epidermici tagliando con una forbicina ricurva. Nella tinea capitis bisogna strappare con una pinzetta depilatoria almeno 20- 30 capelli scegliendo quelli «tronchi» o che presentino alterazioni di lucentezza e colore. Infine nelle onicomicosi il prelievo viene eseguito asportando con forbici, o con un tronchesino, piccoli frammenti della lamina parassitata e/o raschiando con un coltellino la porzione ventrale della lamina ungueale e il solco sottoungueale.

Prima dell'osservazione microscopica il materiale prelevato va fatto macerare e/o chiarifificare. I reattivi più usati sono :

  • l'idrato potassico o potassa caustica (KOH) dal 10 al 40% ( il più usato);

  • l'idrato potassico con DMSO (ha il vantaggio di accorciare i tempi di macerazione e può trovare

indicazione per i capelli e i frammenti ungueali);

  • l'idrato potassico con glicerina (permette di conservare il preparato per 24-48 ore);

  • il clorallattofenolo (permette di conservare i preparati per qualche giorno).

Ai reattivi maceranti e/o chiarificanti possono essere aggiunti diversi coloranti (quali il blue Parker o il blu cotone, il clorazolo nero E) che permettono di ottenere una migliore visualizzazione degli elementi fungini.

Al materiale posto su un vetrino portaoggetto viene aggiunta una goccia di reagente e si copre con un vetrino coprioggetto senza premere; si aspetta qualche minuto (si può riscaldare il preparato sulla fiamma per facilitare la macerazione) e quindi si esercita una leggera pressione sul vetrino coprioggetto in modo da ottenere un uniforme spappolamento e una stratificazione del materiale.

L’osservazione microscopica viene eseguita preferibilmente a contrasto di fase: gli elementi fungini, in particolare le ife, appaiono rifrangenti, quasi verdastri in contrasto con il chiaro citoplasma delle cellule epiteliali. L 'osservazione viene fatta dapprima a piccolo ingrandimento (usando un obiettivo 10x) per ricercare gli elementi fungini, poi a maggior ingrandimento (con un obiettivo da 25 o 40 x) per confermare la natura micetica degli elementi e per studiarne la morfologia (Fig. 1-8).

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L'esame microscopico diretto non sempre permette di distinguere i dermatofiti, i lieviti e le muffe: solo gli accertamenti colturali permettono di ottenere questa informazione.

In caso di parassitamento dei capelli si possono avere 2 aspetti microscopici a seconda anche della specie infettante (Fig. 9-14) :

 

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  1. parassitamento ectothrix (di solito da dermatofiti del genere Microsporum), caratterizzato da piccole artrospore all'esterno del pelo che, quando sono disposte a manicotto, sono tipiche dell'infezione da Microsporum canis ;

  2. parassitamento endothrix (di solito da dermatofiti del genere Trichophyton) con numerose grosse artrospore all'interno del capello che assume un aspetto a «sacco di noci» (Fig. 6) .

  3.  

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Talvolta si osservano al microscopio alcune strutture non fungine (i cosiddetti artefatti) che, somigliando agli elementi fungini, possono portare ad errori interpretativi (Fig. 15-18).

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Più frequentemente queste strutture sono costituite da:

  • fibre di cotone che possono essere confuse con le ife;

  • goccioline di grasso che possono essere confuse con le artrospore;

  • il cosiddetto «pseudofungo a mosaico», ovvero cristalli di colesterolo che precipitano con il KOH e depositandosi lungo i margini cellulari possono essere confusi con ife settate.

2) Tecniche microscopiche particolari

Tra queste ricordiamo le tecniche di fluorescenza, ad esempio con blankophor (sbiancante della carta) che si lega selettivamente alla cellulosa e alla chitina della parete fungina (Fig. 19). I lunghi tempi di preparazione e i costi della tecnica non permettono la sua utilizzazione nella diagnostica di routine, riservandola a casi particolari

 

19

 

3) Esame istologico

Le indagini istopatologiche (colorazione Gomori-Crocott, colorazione di Gridley e reazione PAS) trovano indicazione solo nelle dermatofitosi profonde, in particolare nelle forme croniche (granuloma del Majocchi) e in alcuni casi di onicomicosi (Fig. 20-23).

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Isolamento ed identificazione del micete

L 'isolamento del micete viene ottenuto mediante l'esame micologico colturale che permette la distinzione tra le varie specie di dermatofiti.

Per i dermatofiti i terreni più usati sono le modificazioni del terreno di Sabouraud-glucosio-agar aggiungendo antibiotici (penicillina G, gentamicina solfato, streptomicina, cloramfenicolo) per evitare l’inquinamento batterico e cicloeximide per evitare la contaminazione delle muffe. In caso di sospetta infezione da funghi non dermatofiti (ad esempio in presenza di un’onicomicosi) è necessaria la semina anche su terreni senza cicloeximide. Il Dermatophyte Test Medium (DTM) contiene un indicatore (rosso fenolo) che in presenza di metaboliti alcalini dei dermatofiti fa virare il colore del medium da giallo a rosso (Fig. 24-25). La percentuale di specificità di questa reazione è calcolata intorno al 98%.

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L’identificazione di genere e di specie dei dermatofiti viene eseguita sulla base dei seguenti criteri:

  • morfologia macroscopica delle colonie (Fig. 26);

  • morfologia microscopica delle colonie (Fig. 27);

  • determinazione delle necessità nutrizionali e dei caratteri fisiologici;

  • test di invasione del capello in vitro;

  • PCR.

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    27

    Di solito per l’identificazione di specie è sufficiente l’osservazione macro e microscopica delle colonie. In alcuni casi è necessario il trapianto su terreni addizionati di vitamine (ad es. tiamina per il Trichophyton verrucosum o niacina per il Trichophyton equinum). Può rendersi anche necessario, per differenziazione specie similari, lo studio dei caratteri fisiologici, ad esempio mediante il test dell’ureasi che permette di distinguere il Trichophyton mentagrophytes (capace di scindere l'urea contenuta nell'apposito terreno) dal Trichophyton rubrum, (incapace di scindere l’urea).

    La PCR, di recente introduzione, non trova applicazione almeno per ora nella diagnostica routinaria.

    Riferiremo brevemente sui caratteri macro e microscopici delle colonie delle specie dermatofitiche di più recente riscontro nella pratica dermatologica.

    Trichophyton rubrum

    Dal punto di vista morfologico si distinguono diversi tipi di colonie, di cui le più frequenti sono:

    - tipo lanuginoso con superficie lanuginosa e presenza di umbone centrale. Il «diritto» è di colorito bianco e con il tempo diventa rosa, il «rovescio» presenta colore rosso-vinoso che non diffonde nel terreno (Fig. 28);

     

    28

     

    • tipo granulare con superficie polverulenta di colore crema o rosa al «diritto» e «rovescio» di colore rosso-ciliegia intenso;

    • tipo melanoide con superficie vellutata di colore bianco al «diritto» e con «rovescio» di colore bruno-nerastro.

    Le colonie dei tre tipi con l'invecchiare tendono ad assumere alla periferia un colore rossastro.

    Per quanto riguarda l’aspetto microscopico nel tipo lanuginoso e melanoide sono presenti numerosi microconidi piriformi o cilindrico-clavati (a goccia) disposti per lo più in acladium (Fig. 29). I macroconidi (lunghi, cilindrici, sottili) non si osservano quasi mai. Nel tipo granulare i macroconidi sono più frequenti e che talora sono attaccati l'uno all'altro come quelli dell' Epidermophyton floccosum (vedi dopo).

     

    29

     

     

    Microsporum canis

    Le colonie (su terreno Sabouraud-glucosio-agar-PAS) sono piane, a contorni sfrangiati con superficie cotonosa, granulosa o polverulenta. Il «diritto» della colonia presenta colore bianco-giallastro che diventa più evidente con la crescita, il «rovescio» si caratterizza per il colore giallo intenso (Fig. 30). Dal punto di vista microscopico mostrano macroconidi (abbondanti) grandi e di forma fusata, con estremità affusolate, poliloculati (da 6 a 12 celle), con pareti spesse e superficie rugosa (Fig. 31). I microconidi, piriformi, sono scarsi.

    30

    31

    Tricophyton mentagrophytes

    Su terreno Sabouraud-glucosio-agar-PAS si riconoscono due forme diverse di colonie:

    - tipo granulare con superficie finemente polverosa caratterizzata dalla presenza di cerchi concentrici e contorni marcatamente sfrangiati. Il «diritto» ha colore che varia dal crema al marrone camoscio-chiaro, il "rovescio" è di colore rosso brunastro (Fig. 32);

     

    32

     

    -tipo vellutato con superficie lanuginosa e più o meno numerose plicature raggiate e circolari di colore bianco, tendente al rosa nelle colonie vecchie. Il "rovescio" è di colore giallo-rosa-bruno-rossastro.

    Per quanto riguarda l’aspetto microscopico le colonie di tipo granulare hanno abbondanti macroconidi cilindrico-clavati con pareti sottili, poliloculati (fino a 4 celle) e microconidi sferici che nascono su conidiofori pluriramificati e presentano aspetto a grappolo. Sono inoltre presenti numerose strutture accessorie, in particolare ife spiralate e organi nodulari (Fig. 33).

     

    33

     

    Nel tipo vellutato i macroconidi sono rari e i microconidi, abbondanti anche se meno numerosi che nel tipo precedente, hanno una forma a lacrima, per cui talora è difficile la distinzione con il T. rubrum ed è necessario ricorrere al test dell’ureasi.

    Epidermophyton floccosum

    Le colonie sono poco rilevate, cerebriformi al centro, plicate radialmente verso la periferia. La superficie può essere vellutata o polverulenta. Il colore al "diritto" varia dal giallo-mostarda al verde oliva, mentre il "rovescio" è giallo-bruno (Fig. 34).

     

    34

     

    La micromorfologia si caratterizza per la presenza di numerosi macroconidi clavati con derivazione da un’unica ifa conidiofora (a "casco di banana") uni- o pluriloculati (fino a 4 celle), con parete spessa e superficie liscia (Fig. 35). I microconidi sono sempre assenti. Nelle colonie più vecchie si rendono evidenti numerose clamidospore.

     

    35

     

     
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